??????? 一、分離模式
??????? 選擇色譜柱的首要任務(wù)是選擇分離模式。分離分子的方法有很多，其中應(yīng)用最廣泛的包括反相、正相、親水相互作用、離子交換和尺寸排阻 HPLC。還有一些不太常見但更專業(yè)的分離模式，例如使用手性固定相或流動相的特定手性色譜。
??????? 反相色譜柱通常用于非極性或弱極性有機化合物，它包含非極性固定相（如 C18），通常與極性流動相配對。恒譜生C18 AQ 反相色譜柱在100%水下?lián)碛谐酵惍a(chǎn)品的壽命，適于極性較大的物質(zhì)在高水相條件下的分析。但是該方法不適合應(yīng)用于蛋白質(zhì)，流動相通常含有低 pH 值的乙腈或甲醇，可能會使蛋白質(zhì)變性，因此會產(chǎn)生偽峰或?qū)е碌鞍踪|(zhì)聚集和色譜柱堵塞。
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??????? 二、柱長
??????? 確定分離模式和色譜類型后，請考慮色譜柱長度。理想的柱長在某種程度上取決于您的特定樣品和分離模式。一般來說，更長的色譜分析柱需要更長的運行時間，但會產(chǎn)生更好的分離效果。柱長（有時稱為“床高”）對于根據(jù)大小分離蛋白質(zhì)特別重要。
??????? 三、填料的大小和類型
??????? HPLC 柱床由直徑通常為 2 至 10 μm 的球形功能顆粒構(gòu)成。小于 2 μm 的粒徑用于UHPLC，超高壓液相色譜是在非常高的壓力下運行，因此它使用比 HPLC 更小的顆粒。恒譜生2μm硅膠基質(zhì)色譜填料，孔分布均勻、抗壓強度高，由于表面羥基活性高所以在中高壓情況下能達到快速分離純化的效果。一般而言，較小的粒徑可提供更高的分離率——但需要注意的是背壓也更大，以便將流動相泵入密度更大的色譜柱。
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??????? 三、色譜填料的材料
??????? 常見的選擇有二氧化硅、羥基磷灰石和交聯(lián)聚合物樹脂。常見的疏水烷基鏈有 C4、C8 和 C18 等長度。通常，該材料對目標(biāo)分析物具有一定程度的選擇性——做出這種選擇對于優(yōu)化分離度很重要。例如，C18 更常用于分離肽或小分子，而 C4 更適用于蛋白質(zhì)。
??????? 技術(shù)發(fā)展也產(chǎn)生了新的粒子類別。一種稱為表面多孔顆粒 (SPP) 或核殼顆粒的新型二氧化硅基材料有望實現(xiàn)通過2 μm的粒徑實現(xiàn)更高的分離效率。通常，常規(guī)粒徑小于 2 μm 的 HPLC 色譜柱需要專門的 UHPLC 泵或系統(tǒng)來處理較高的背壓。與球形和全多孔的傳統(tǒng)二氧化硅顆粒不同，SPP 顆粒由一個實心二氧化硅核組成，其上覆有多孔二氧化硅殼，這些顆粒的優(yōu)點是它們表現(xiàn)出像 2 微米顆粒一樣的效率，顆粒尺寸從 2.6 微米及以上，但在略高于一半的背壓下運行。
發(fā)布于: 2022-03-11